PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)污染原因及預(yù)防

 PCR 反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但極易被污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

一、污染原因:

1、標(biāo)本間交叉污染：

標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

2、PCR 試劑的污染：

主要是由于在 PCR 試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。

3、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染：

這是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大（一般為 1013 拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。
還有一種容易忽視，最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含 48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。

4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。

二、污染的預(yù)防：

進(jìn)行 PCR 操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最 da 程度地降低可能出現(xiàn)的 PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

1. 劃分操作區(qū)：

目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
(1) 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備。
(2) 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR 擴(kuò)增。
(3) 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。
(4) 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專(zhuān)用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR 擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

2. 分裝試劑：

PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的 DNA 和其他來(lái)源的 DNA：
(1) PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。
(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無(wú) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。
(3) 引物和 dNTP 應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

3. 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。
(2) 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與 PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3) 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
(4) 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
(5) 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。
(6) 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證 PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本 DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少 PCR 操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。
(8) 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。