PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)基本步驟解析

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于擴(kuò)增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，最終完成特定基因的體外復(fù)制。PCR實(shí)驗(yàn)基本由變性、退火、延伸三個(gè)步驟完成。

1、 模板DNA的變性

模板DNA加熱到90~95℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，以便它與引物結(jié)合。變性溫度低則變性不完全，dna雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度不能過高，變性時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持taqdna聚合酶的活力。PCR中DNA變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。G-C間由三個(gè)氫鍵連接，而A-T間只有兩個(gè)氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高。對于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段進(jìn)行熱啟動。

2、模板DNA與引物的退火

將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時(shí)，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物，即復(fù)性。退火溫度決定PCR產(chǎn)物的特異性與產(chǎn)量。退火溫度高，特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；退火溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的解鏈溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：Ta =Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃。在反應(yīng)體系中引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并且引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時(shí)，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多。退火時(shí)間一般為1～2min。

3、引物的延伸

DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。引物延伸溫度的選擇取決于DNA聚合酶的最適溫度, 一般為70～75℃。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長度。一般在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個(gè)堿基/秒,其速度取決于緩沖溶液的組成、ph值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。

PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝（1＋X）n計(jì)算。

Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%。反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺效應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。引物如果跟原始DNA模板結(jié)合，從3'端開始擴(kuò)增延伸，其產(chǎn)物的5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。引物如果是以新合成的DNA鏈（即“長產(chǎn)物片段”）為模板擴(kuò)增時(shí)，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸鏈的3'端是固定的，使新合成DNA鏈的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。由于新合成的DNA鏈在下一個(gè)循環(huán)反應(yīng)中可以作為引物結(jié)合擴(kuò)增的模板，“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加。而原始DNA模版的量是固定的，“長產(chǎn)物片段”只按算術(shù)倍數(shù)增加，在最終PCR中的含量幾乎可以忽略不計(jì)。

一般PCR反應(yīng)包括上述變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。但在擴(kuò)增某些較短目標(biāo)序列（長度為100～300bp時(shí)）時(shí)，可采用二溫度點(diǎn)法，即把退火與延伸溫度合二為一。

4、 循環(huán)次數(shù)

PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個(gè)。循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。